【翻译】MSH3 Homology and Potential Recombination Link to SARS-CoV-2 Furin Cleavage Site
SARS-CoV-2 和蝙蝠 RaTG13 冠状病毒的多个点突变中，仅有 12 个核苷酸长度的 弗林蛋白酶 裂解位点（FCS）有超过三个核苷酸的差异。通过 BLAST 检索发现 SARS.Cov2 基因组中包含标记裂解位点的 19 个核苷酸部分与密码子优化专有序列（人类 MSH3 的补充序列） 100% 互补。SARS-Cov-2 中出现的反向互补序列可能是随机出现的但也有必要考虑其他可能。中间宿主内发生重组不像可能的解释。SARS-Cov-2 这类单链 RNA 病毒利用感染细胞的 RNA 负链作为模板，这有可能导致 SARS-CoV-2 反义链 RNA 与细胞内 MSH3 负链（包含 FCS）发生复制选择重组入病毒基因组。无论如何，这段包含 FCS 19 个核苷酸，且与 MSH3 mRNA 100% 反向互补的 RNA 序列的出现都是高度反常的并需要进一步研究。
关键词：SARS-CoV-2 刺突蛋白，弗林酶裂解位点，MSH3 基因，序列同源物，重组
前言
基于近期发表的一篇描述SARS-CoV-2插入变异的文章，我们带来了我们近期在 SARS-CoV-2 刺突（S）蛋白中弗林酶裂解位点 （FCS）序列的研究。SARS-CoV-2 造成了 COVID-19 流感，与蝙蝠冠状病毒 SL-CoVZC45 存在 82.3% 的核苷酸相似，与 SARS-CoV 有 77.2% 的核苷酸相似，同时与蝙蝠冠状病毒 RaTG13 基因组序列相似性达 96.2% 。在 SARS-CoV-2 和 RaTG13 的多个点突变中，仅有一个插入和三个核苷酸的插入： 12 个核苷酸，其编码 SARS-CoV-2 S 蛋白中发现的 4 个氨基酸（aa 681-684, PRRA）。这种多元 FCS 将 SARS-CoV-2 与其他 b 系 β 冠状病毒或任何其他沙贝病毒区分开来。FCS 的插入增强了 SARS-CoV-2 在 2019 年的感染能力。而 FCS 缺失使SARS-CoV-2 减毒变体其可用于动物疫苗接种，这与人类感染相关。FCS 在人和雪豹间传播至关重要，其将病毒传播至人类细胞，并造成两种 SARS-CoV-2 动物模型的严重疾病。
{% asset_img 20220325123356.png 图1 %}
图1：SARS-CoV-2 中弗林蛋白酶的原始序列。比对 SARS-CoV，RaTG13 和 SARS-CoV-2 在 S1/S2 连接处的蛋白序列，表明弗林蛋白酶裂解位点（FCS）PRRA 仅在 SARS-CoV-2 中出现。基于 BLAST 检索结果这段编码 FCS PRRA 的 12 核苷酸片段与专利（US 9587003）中 19 核苷酸长的特异序列（Seq ID11652）完全一致。Seq ID11652 转录为 MSH3 mRNA 似乎针对人类密码子进行了优化。这 19 核苷酸的序列包含了人类 MSH3 基因中 12 个编码 FCS PRRA 的核苷酸，可能通过在感染 SARS-CoV-2 人类细胞中复制选择重组机制介导入 SARS-CoV-2 基因中，并过表达 MSH3 基因，如上图所示。
SARS-CoV-2 刺突蛋白和 MSH3
这段序列中两个连续的 CGG 密码子的一个奇怪特性是编码 SARS-CoV-2 S 蛋白 PRRA 的弗林蛋白酶裂解位点。该精氨酸密码子在冠状病毒中很罕见：CGG在穿山甲 CoV 中的同义密码子相对使用度（RSCU）为 0，蝙蝠中为 0.08，SARA-CoV 为 0.19，MERS-CoV 中为 0.25，SARS-CoV-2 中为 0.299。
我们的 BLAST 检索结果发现，插入的这 12 个核苷酸与特异序列（Seq ID11652） 100% 反向互补配对，该序列在 2016 年 2 月 4 日的美国专利 9587003 中。Seq ID11652 检测结果显示 12 个核苷酸的匹配扩展插入到 19 个核苷酸序列：5′-CTACGTGCCCGCCGAGGAG-3′ （SEQ ID11652 的 2733-2751 个核苷酸），进而合成的 mRNA 将包含 3′- GAUGCACGGGCGGCUCCUC-5′ ，即 5′- CU CCU CGG CGG GCA CGU AG-3′ （SARS-CoV-2 基因组中 23547-23565 的核苷酸，其中四个加测的密码子产生 PRRA，刺突蛋白中 681–684 的氨基酸）。以上结果在 NCBI BLAST 数据库中非常罕见。
SARS-CoV-2 中这以序列和反向互补的特异性 mRNA 序列来源未知。传统的生物统计学分析表明，该序列随机出现在3万个核苷酸病毒基因组中的概率为 $3.21 \times 10^{-11}$ 。
{% asset_img 20220325130802.png 图2 %}
图2：研究中 19 核苷酸序列自然出现的可能性计算。SARS-CoV-2 基因组大约 30000 核苷酸长（P1）。专利序列约 3300 核苷酸长（P2）。专利的序列库包含 24712 个不同长度的序列，中位长度在 3300 左右。经典可能性计算给出人类基因组中的 19 核苷酸序列（也是专利序列库中序列之一）的自然出现概率。
特异序列 Seq ID11652 自上游开始读取，将编码与人类为 mutS 同源物 3（MSH3） 100% 匹配的氨基酸。MSH3 是 DNA 错配修复蛋白（MutS β 复合体的一部分）。Seq ID11652 转录为 MSH3 mRNA 似乎针对人类密码子进行了优化。除了 SARS-CoV-2，我们在任何的真核细胞或病毒基因组和 BLAST 数据库中均为发现这一 100% 重叠的 19 核苷酸序列。
讨论
使用密码子优化的 mRNA 序列替换 MSH3 在人体中表达，已在有错配修复失调的癌症中应用。但是在 SARS-CoV-2 中出现一片段完全反向互补的序列可能是随机的，同时其他可能也值得考虑。
已知过表达 MSH3 干扰错配修复（MSH2 从包含 MSH2 和 MSH6 的 MutS α 复合体中分离，导致 MSH6 降解和 MutS α 耗尽），这一功能具有病毒学意义。介导 DNA 错配修复将带来人呼吸道细胞甲型流感病毒易感性及致病性的增加。错配修复失调还会为 SARS-CoV-2 增加保护性。
CTCCTCGGCGGGCACGTA 在任何真核细胞或 BLAST 数据库的病毒基因组中都不存在，用来解释中间宿主重组，并不是其在 SARS-CoV-2 中出现的合理解释。在本病毒研究中，这一人类密码子优化的 mRNA 所编码人类 MSH3 的 100% 同源物无意中或故意诱导人类细胞系中的不匹配修复缺陷，并增加对 SARS 样病毒的易感性。使用 SARS 样病毒感染 SEQ ID11652-MSH3 转染的人类细胞将引发复制选择重组。SARA-CoV-2 和其他含正义链的单链 RNA 病毒通过在感染细胞胞质内启动q负链合成完成复制。负链 RNA 作为合成的正链RNA的模板，同时用于合成翻译非结构蛋白（复制和转录复合体），或新的病毒性衣壳。冠状病毒在感染早期同构基因组复制和 mRNA 翻译生成双连 RNA。
通过带反义链的 SARS-CoV-2 RNA 中间宿主中发生复制选择重组，将模板从一链转入另一链，可以利用过表达 MSH3 mRNA 正义链获取 FCS 的反向互补序列。SARS-CoV-2 和其他已知的冠状病毒之间的同源性是不连续的，同时大部分 SARS-CoV-2 序列是源 RaTG13 相对近的祖先。此外，相似性图（SimPlots）在两者序列之间发现的突变，是潜在重组事件的信号，这就可以解释 SARS-CoV-2 能通过 RBD 与 ACE2 结合，而 RaTG13 不能。
本假设的一个不足在于比对所用的序列在 Seq ID11652 另一链上开放阅读框内。但是使用 MSH3 转染细胞将诱导错配修复失调，导致双连 cDNA 编码 Seq ID11652。这种细胞与表达 RdRp 的 SARSS 样病毒共转染后，可以连接到这个 19 核苷酸序列，并允许从负f链中的一个片段（包括 FCS）整合到病毒基因组中，尽管其位于开放阅读框的另一链上。错配修复机制使得在实验模型中从反义链整合小片段成为可能。微同源性可以指导中 MSH3 和 SARS 样病毒之间的重组，就如发生在 19 个核苷酸序列上的一样。
这个出现在 SARS-CoV-2 中的 19 核苷酸 RNA 序列很不寻常，其能够编码位于刺突蛋白 681 处氨基酸的 FCS，且与特异 MSH3 mRNA 序列 100% 反向互补配对。它最可能的解释应当进一步调查。
补充材料
# Sequence 11652 from patent US 9587003
GenBank: KH664781.1
LOCUS KH664781 3387 bp DNA linear PAT 14-OCT-2017
DEFINITION Sequence 11652 from patent US 9587003.
ACCESSION KH664781
VERSION KH664781.1
KEYWORDS .
SOURCE Unknown.
ORGANISM Unknown.
Unclassified.
REFERENCE 1 (bases 1 to 3387)
AUTHORS Bancel,S., Chakraborty,T., de Fougerolles,A., Elbashir,S.M.,
John,M., Roy,A., Whoriskey,S., Wood,K.M., Hatala,P., Schrum,J.P.,
Ejebe,K., Ellsworth,J.L. and Guild,J.
TITLE Modified polynucleotides for the production of oncology-related
proteins and peptides
JOURNAL Patent: US [9587003](https://patft.uspto.gov/netacgi/nph-Parser?patentnumber=9587003)-B2 11652 07-MAR-2017;
ModernaTX, Inc.; Cambridge, MA
REMARK CAMBIA Patent Lens: US [9587003](https://www.lens.org/lens/search/patent/list?q=US%209587003)
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..3387
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/mol_type="genomic DNA" ORIGIN
1 atgagcagaa gaaagcccgc cagcggcggc ctggccgcca gcagcagcgc ccccgccaga
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